前言

如果您还没有建立 HPLC 方法，要进行稳定而重复的分析，就需要进行方法开发了。具备进行成功方法开发的技能，对解决将来可能遇到的复杂分析极有帮助。

方法开发的总体目标是在尽可能短的时间内优化目标物的分离度。当您开始考虑进行方法开发时，最好先回顾一下分离度的关键影响因素。可以复习色谱基本概念 。传送门→→→ “色谱柱的基本概念”

典型的方法开发流程包含以下步骤，同时也是本章内容的主线：

1. 选择分离模式

2. 选择色谱柱和填料规格

3. 选择固定相填料

4. 选择流动相溶剂

5. 如果分离模式需要，调节流动相的 pH

6. 进行等度或梯度初步实验，以确定边界条件

7. 优化实验条件

模式选择

您应该做的第一件事就是选择 HPLC 模式。通常分离模式是由以下因素决定的：目标物的类型和溶解度、目标物分子量（MW）、样品基质以及可使用的固定相和色谱柱。

许多色谱工作者都是以反相 HPLC 开始分离，因为反相色谱已发表了许多应用文章可供参考。用反相色谱可以分析非极性、非离子型、离子型和极性化合物，选择适当的流动相和分析条件，有时整个分析都可以仅用这一种模式完成。继反相色谱之后，我们还将在本章的最后讨论其它分离模式。

选择色谱柱和填料规格

要进行高通量分析，小粒径短柱（如亚 2 μm）是最佳选择。如果您要对包含多种组分的样品进行复杂的分离，可以选择填充小粒径填料的长柱，切记，这

种色谱柱的操作压力可能会显著增加。如果您要进行质谱分析，窄内径柱（如 2.1 mm 内径）是最佳选择，因为与质谱检测器联用需要较低流速。制备色谱常使用填充较大粒径填料（5 或 10 μm）的大内径柱。对于这种色谱柱，高流速正好与制备柱的流量需求相匹配。

填料的孔径非常重要，因为待测分子必须与多孔结构“相匹配”，才能与固定相发生相互作用。较小孔径的填料（孔径 80 到 120Å）最适合分离分子量 2000 以下的小分子。对于分子量超过 2000 的较大分子，需要使用较大孔填料；例如，分离蛋白质的常用孔径是 300 Å。

对大多数分离来说，都可以使用不锈钢柱硬件。但是，如果您要分析的是可能与金属表面发生相互所用的敏感分子，如某些类型的生物分子，则需要使用 PEEK 或玻璃内衬不锈钢等柱材料。对于痕量阳离子的分离，PEEK 柱的惰性最高。请注意，PEEK 柱的压力上限为 400 bar。

选择固定相

有包含各种分离模式的多种固定相可供选择。许多色谱工作者都以最通用的十八烷基硅烷化（C18）固定相开始进行反相色谱分离，尤其是对小分子的分离。下面我们将着重讨论反相分离的问题，本章后面部分再涉及其它分离模式。

反相色谱是到目前为止最通用的 HPLC 方法——大约占所有方法的 60%，将近 95% 的色谱工作者都在使用。

在反相色谱中，分析物在极性流动相和非极性固定相之间分配——与正相色谱相反。通常，分析物与疏水固定相之间发生非极性、非特异性相互作用，即，样品分配入固定相。我们使用 C18、C8、苯基或 C3 等固定相，产生极性差异和/或基于分子芳香结构的差异。

极性较强的分析物比非极性分析物在反相固定相中的保留弱。保留与分析物的疏水性基本上成正比。具有大疏水基团和带较长烷烃链的同系物，比结构中带极性基团的分子（如氨基、羟基）保留更强。如果有一系列脂肪酸，如 C12、C14、C16 和 C18，则 C12 保留最弱，C18 保留最强。

流动相主要由两部分组成：

1. 水，可含缓冲液，或用酸或碱调节 pH

2. 可与水混溶的有机溶剂

反相色谱有多种用途，有时在同一色谱分析中就可以分离非极性、极性、可离子化的和离子型分子。一般来说，对于可离子化的化合物，为了增加保留和改善峰形，我们会在流动相中加入改性剂，以抑制离子化，减弱其极性，使其保留更强。

了如何根据特定分析物的分子量选择合适固定相的一般流程。首先，必须选择孔径，以确保目标分子能够进入填料，在孔隙中与疏水固定相发生相互作用。然后，选择固定相，多数情况下是从 C18 固定相开始。根据方法的最终目标不同，可以选择常规分析柱，如果需要进行高通量分析，可以选择“快速分析”反相色谱柱。

大多数色谱工作者是从 C18 固定相开始，但如图 34 所示，如果 C18 不能进行有效分离，其它固定相也可以提供不同的选择性。在本例中，我们在含不同亚 2 μm 填料的快速分离高通量短柱上分离了心血管药物，使用含70% 磷酸盐缓冲液（pH 3.0）和 30% 乙腈的等度缓冲流动相。

虽然，所有色谱柱都使样品中的 5 种药物得到了完全或部分分离，但 SB-CN 柱不仅分离度足够，而且分离速度最快。

原则上，应该选择符合样品需求的固定相。疏水性小分子应首选较长链烷烃键合相，如 C18。如果在 C18 固定相上保留过强，再选择较短链的 C8 或 C3 固定相。C8 固定相与 C18 具有相似的选择性，但保留稍弱。对于疏水性很强的分子，最好使用短链固定相，如 C3。如果待分析物分子具有芳香结构，在烷烃固定相上不能完全分离，可以使用芳香键合相，如苯基或二苯基。在本例中，目标分析物具有强极性，在一般的反相色谱填料上不保留或保留很弱，可以考虑换一种 HPLC 分离模式，用亲水相互作用色谱 (HILIC)。如果在方法开发过程中，必须使用高 pH 条件，就要选择为高 pH 下操作而设计的固定相，如 Extend-C18，或聚合物固定相，如 PLRP-S。短链固定相在高 pH 值下不稳定，可能发生硅胶溶解。